Protocolli di coniugazione FITC

fluoresceina isotiocianato , comunemente indicato come FITC - pronunciato " fit -c ", a rima con " frivole " - è un marcatore fluorescente che è legato chimicamente , o coniugati , ad altre molecole come le proteine ​​e anticorpi . Un anticorpo coniugato con FITC potrebbe anche essere definito come un " anticorpo marcato con FITC . " FITC è eccitato da luce alla lunghezza d'onda di 488 nm ed emette energia fluorescente rilevata a 530 nm . Uno scienziato può vedere con un microscopio o uso apparecchiature fluorescenti che rileva le emissioni fluorescenti e le registra . Metodi

FITC coniugazione segue un protocollo di base . Per esempio , un anticorpo FITC e sarebbero mescolati insieme in un certo rapporto in una provetta e ruotati a temperatura ambiente per un'ora . Per rimuovere il FITC non legato dalla soluzione , viene versato su una colonna cromatografia di affinità - un tubo di vetro riempito con un gel tallone -like che legherà il FITC non coniugata . Nel frattempo , l'anticorpo marcato con FITC fluirà attraverso la colonna e viene raccolto per l'uso .
Considerazioni

Prima di iniziare una coniugazione , il ricercatore deve considerare diversi punti. In primo luogo , FITC è altamente instabile e non deve essere esposto alla luce - va tenuto in tubi stagnola coperte in ogni momento. Secondo, il tempo e la temperatura coniugazione possono essere alterati per una proteina sensibile alla temperatura . Infine , diverse proteine ​​e anticorpi possono avere capacità differenti FITC vincolanti , in modo da trovare il corretto rapporto di anticorpi FITC è critica ; troppo poco FITC rende un anticorpo non rilevabili e troppo può alterare la sua specificità . Per questo motivo , preliminari coniugazioni su piccola scala a differenti rapporti di FITC per anticorpi devono essere installati in parallelo. Una volta che il rapporto ottimale è stabilito, la coniugazione di grandi dimensioni può essere eseguita .
Usi

Medici e scienziati utilizzano anticorpi coniugati con fluoresceina , gli ormoni e la crescita fattori in un ampia varietà di saggi e applicazioni. Per esempio , una cellula staminale trova nel sangue ha una molecola sulla sua superficie chiamato CD34 . Un tecnico di laboratorio può mescolare il sangue di un paziente con un anticorpo marcato con FITC specifico per CD34 , ed eseguire le cellule attraverso un citometro di flusso che utilizza un raggio laser per rendere il FITC fluorescenza . Successivamente, il citometro separa le fluorescenti cellule CD34 dal resto delle cellule del sangue , e di medici in grado di utilizzare queste cellule staminali isolate per trattamenti terapeutici .

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