Quando i microscopi furono inventati intorno al 1600 E.V., i filosofi naturali volsero gli occhi su un mondo all'interno di un mondo. Quando Antony van Leeuwenhoek ha realizzato piccole lenti altamente curve e un supporto meccanico per regolare la vista, ha aperto una finestra sul microscopico mondo di batteri, cellule del sangue, protozoi e la struttura cellulare delle piante. Ma nel corso della storia della microscopia, c'è sempre stata una domanda: quali sono queste strane cose viste attraverso una lente? La microscopia a fluorescenza si riferisce a una serie di tecniche che minimizzano tale incertezza - perché nella microscopia a fluorescenza quando la luce viene riflessa su un campione, fa risplendere la propria luce.
Epifluorescenza
Di gran lunga il il microscopio a fluorescenza più comune è la configurazione di epifluorescenza. In un microscopio a epifluorescenza, una fonte di luce - in genere una lampada al mercurio o allo xeno - brilla attraverso un filtro che seleziona una regione ristretta di lunghezze d'onda. La luce filtrata brilla sul campione attraverso l'obiettivo del microscopio. La luce in arrivo viene assorbita dai fluorofori - etichette molecolari che emettono luce di una lunga lunghezza d'onda quando assorbono luce di una lunghezza d'onda più breve. La luce dei fluorofori, insieme alla luce diffusa dalla fonte di illuminazione, ritorna nella lente dell'obiettivo e nel rivelatore o nell'occhio. Lungo la strada, un altro filtro blocca la luce di illuminazione, quindi tutto ciò che rimane è la luce fluorescente del campione.
Confocal
Un microscopio a epifluorescenza raccoglie la luce da qualsiasi parte del campo visivo del microscopio . Parte della luce di eccitazione viene assorbita prima del piano focale del microscopio, alcune sul piano focale e altre oltre il piano focale. Poiché il microscopio raccoglie tutta quella luce, l'immagine conterrà un'immagine nitida della luce nel fuoco, ma avrà anche luce sfocata proveniente da altre regioni. Un microscopio confocale corregge la messa a fuoco focalizzando un punto laser sullo stesso piano del microscopio. Quindi, un foro stenopeico si trova di fronte al rilevatore, dove blocca tutta la luce che non proviene dal fuoco del microscopio. Attraverso la scansione del campione, è possibile ottenere un'immagine tridimensionale pulita dell'oggetto.
Multifotone
In un microscopio confocale l'allineamento è molto sensibile. Se il punto laser, l'obiettivo del microscopio, l'ottica di raccolta e il foro stenopeico sono spenti anche il minimo delle prestazioni del microscopio. Un microscopio multifotonico aggira questo problema usando una lunghezza d'onda laser che è solo la metà dell'energia necessaria per eccitare i fluorofori nel campione. L'unico modo in cui i fluorofori si eccitano ed emettono fluorescenza è se la luce laser è abbastanza luminosa da far sì che due particelle di luce - i fotoni - colpiscano il fluoroforo in brevissimo tempo. Ciò accade solo quando il laser è focalizzato su un punto molto piccolo. Quindi l'unico posto nel campione che emetterà luce è dove viene focalizzato il laser, il che mantiene l'immagine bella e pulita perché non c'è luce di sfondo in più da eliminare - il che significa che nessun foro stenopeico da allineare.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)
Un altro modo per ottenere immagini molto pulite è assicurarsi che la luce di eccitazione non arrivi molto lontano nel campione. Se una goccia di neuroni, ad esempio, viene posizionata in una goccia di soluzione su un vetrino, alcuni dei neuroni aderiranno alla superficie del vetro. In un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) la luce viene orientata lateralmente nello scivolo di vetro in modo che non entri nella soluzione che trattiene le cellule. Ma una parte della luce penetra a malapena nella soluzione, molto vicino alla superficie del vetro. Ciò significa che gli unici luoghi che emetteranno luce saranno in una regione molto sottile proprio contro la superficie del vetro. Per qualcosa come i neuroni, dove accadono così tante cose interessanti sulla superficie delle cellule, questa tecnica può essere molto efficace.
Super-risoluzione
Tutti i microscopi - compresi i microscopi a fluorescenza - sono limitati dal fisica che governa la propagazione della luce. Una delle regole di base è che un punto luminoso focalizzato può solo diventare così piccolo - e non più piccolo. Per la luce visibile, quella dimensione è di circa 200 nanometri o 200 miliardesimi di metro. Ma le singole molecole hanno solo pochi nanometri, quindi ci sono molte caratteristiche interessanti che sono al di sotto di quel limite di dimensioni, chiamato limite di diffrazione. Gli scienziati stanno sviluppando tecniche di "super risoluzione" per aggirare questo limite. La microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e la microscopia a riduzione dell'emissione stimolata (STED), ad esempio, sono entrambi metodi di microscopia a fluorescenza che limitano le dimensioni del punto di emissione di luce riducendo le dimensioni del punto di luce di eccitazione.
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